Wie eine PCR – nur schneller und im eigenen Labor.

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Wie eine PCR – nur schneller und im eigenen Labor

Der direkte Erregernachweis mittels PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ist hochspezifisch und inzwischen relativ schnell durchzuführen, allerdings nur in dafür ausgestatteten Labors. Seit über zwei Jahrzehnten wird an Alternativen für den Praxisalltag geforscht, welche die Notwendigkeit des Verschickens und Wartens hinfällig machen. Nun ist dies dank der EPONA-Schnelltests der französischen Firma ENALEES gelungen.

Möglichkeiten des Erregernachweises

Um bei Infektionskrankheiten definitive Diagnosen stellen zu können, bedarf es eines Erregernachweises. Dieser kann direkt oder indirekt erfolgen.

Zu den direkten Nachweisverfahren gehören:
- Mikroskopische Verfahren (u.a. Hellfeld-, Fluoreszenz- oder Elektronenmikroskopie)
- Kulturverfahren (u.a. Bakterien-, Pilz- und Virusanzucht) inkl. weiterführender Tests
- Molekulare Methoden (u.a. PCR, DNA-Sequenzierung, In-situ-Hybridisierung)

Indirekte Nachweisverfahren identifizieren den Erreger anhand der spezifischen Wirts-Reaktion, der Antikörper. Sie umfassen unter anderem:
- Hämagglutinationshemmtest
- ELISA
- Komplementbindungsreaktion
- Western Blot

Nachfolgend wird auf den direkten molekulardiagnostischen Erregernachweis und die Alternativen zur PCR eingegangen.

Molekulare Methoden

Die Molekulardiagnostik kommt vor allem bei anspruchsvollen und schwer kultivierbaren Erregern,  bei Proben mit einer Vielzahl von Erregern (z.B. Magen-Darm-Trakt) sowie bei Tierseuchenerregern zum Einsatz.

Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) zählt seit ihrer Entwicklung 1983 bis heute zu den wichtigsten molekularbiologischen Methoden und ermöglichte enorme Fortschritte der Wissenschaft. Durch die verschiedenen Arbeitsschritte und besonders die unterschiedlichen Temperaturen während der Durchführung wird die PCR stets mittels Thermocycler in spezialisierten Labors durchgeführt.

Schnell wurde begonnen nach Alternativen für den Praxisalltag zu forschen, die schneller, günstiger und einfacher durchzuführen waren. Zu diesen gehören unter anderem:
- Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)
- Self-sustained sequence replication (3SR)
- Strand displacement amplification (SDA)

Mit jeder dieser Methoden wurden Wege gefunden, die Hitzedenaturierung der PCR entweder mit Transkriptions- und Reverse-Transkriptions-Reaktionen (NASBA & 3SR) oder mithilfe Restriktions-Enzym-Verdauung und modifizierten Nukleotiden (SDA) zu umgehen. Allerdings haben sie sich als weniger spezifisch und zu teuer für die Kommerzialisierung herausgestellt.

2000 wurde daraufhin die LAMP-Technologie entwickelt.

LAMP-Technologie

LAMP steht für Loop-mediated isothermal AMPlification. Loop-mediated (dt. schlaufen-vermittelt) bezieht sich hierbei auf die bei der DNA-Amplifikation entstehenden hantel- und blumenkohlförmigen Strukturen. Die Reaktion läuft isothermisch bei einer Temperatur von 60-65°C ab und ist in der Lage, wenige Kopien der Ziel-DNA mithilfe mehrerer Primer und Polymerase milliardenfach zu amplifizieren.

In der Humanmedizin hat sich die LAMP-Technologie bereits etabliert, besonders zur schnellen Diagnostizierung von Tropenkrankheiten, Tuberkulose und Virus-assoziierten Krebserkrankungen.

Mechanismus

Wie auch bei der PCR wird die Ziel-DNA extrahiert und denaturiert, sodass Einzelstrang-DNA vorliegt. Diese wird mit vier Primern und einer Polymerase bei 60-65°C inkubiert. Daraufhin wird die amplifizierte Ziel-DNA mittels Fluoreszenztechnik voll automatisch detektiert.

Es existieren 4 Primer, 2 innere und 2 äußere, welche gemeinsam 6 spezifische DNA Sequenzen der Ziel-DNA erkennen. Die beiden inneren Primer (FIP = forward inner primer & BIP = backward inner primer) binden an je eine spezifische DNA-Sequenz der Einzelstrang-Ziel-DNA und starten die DNA-Synthese. So wird ein neuer DNA-Doppelstrang produziert. Die beiden äußeren Primer trennen diesen Doppelstrang auf und starten ihrerseits eine weitere Runde der DNA-Synthese.

 Die Primer haben unterschiedliche „Schmelztemperaturen“, sodass FIP stets als erstes aktiv wird und den DNA-Einzelstrang vorwärts abfährt. Danach erst werden BIP und die äußeren Primer aktiv. So wird der erste synthetisierte DNA Doppelstrang getrennt und BIP setzt am neu synthetisierten Einzelstrang an.

 Jeder neu synthetisierte DNA-Einzelstrang enthält somit einen inneren Primer und die komplementären Sequenzen des anderen inneren Primers. Da die inneren Primer zusätzlich je eine spezifische Sequenz der Ziel-DNA enthalten, kann diese an die komplementäre neu-synthetisierte Sequenz binden und formt so je eine Schlaufe (engl. Loop). Dadurch falten sich die synthetisierten Einzelstränge an jedem Ende um und formen eine Hantel-Struktur mit je einer Schleife am Ende und einem Steg dazwischen. FIP und BIP können nun außen an den Schlaufen ansetzen und neue DNA-Synthese-Runden initiieren.

Wissenschaftlicher Überblick

Viele wissenschaftliche Studien haben sich seit ihrer Entstehung mit der LAMP-Technologie befasst und sie gegen die herkömmliche PCR getestet.

 Unter anderem wurden die Nachweise von Brucella spp.,  Dichelobacter spp., Mycobacterium spp. und  18 OIE-meldepflichtigen Tierseuchen evaluiert.

 Es konnte schnell bestätigt werden, dass die LAMP-Technologie, selbst vom Laien angewendet und unabhängig des Erregers, im Vergleich zu rtPCR und nPCR eine äquivalente und teilweise höhere Sensitivität besitzt. Auch die Spezifität dieser Methode ist aufgrund mehrerer Primer gleich oder höher als die der PCR. Ebenfalls konnte mehrmals herausgefunden werden, dass aus nur 6 Ziel-DNA-Kopien in unter einer Stunde mehr als 10^9  DNA-Kopien synthetisiert wurden.

 Immer wieder hoben Untersuchungen die Zeitersparnis, das simple Anwendungsprotokoll und die Kostenreduktion der LAMP-Technologie bei gleichbleibender Ergebnisqualität hervor.

Anwendung in der Praxis

Jetzt ist diese molekulardiagnostische Technologie in Form von Schnelltests auf dem Markt. Anfang 2018 führte die französische Firma ENALEES (ENALEES SAS, 91000 Evry, Frankreich) die EPONA-Schnelltests für Infektionskrankheiten des Pferdes ein. 2020 wird das Sortiment für Kleintiere erweitert.

Durch die Verwendung von 8 Primern sind die Schnelltests hochspezifisch und sensitiv, sodass eine einzige Kopie der Ziel-DNA zur Amplifikation genügt.

Mithilfe EPONA ist es möglich, neun verschiedene Infektionserreger des Pferdes innerhalb von 20-30 min wie folgt im eigenen Labor zu diagnostizieren:

1. Probenentnahme: Validierte Probenarten umfassen bis jetzt Vollblut und Tupferproben. Weiterhin wurden Synovia, Eiter, Cerebrospinalflüssigkeit, Urin und Kot evaluiert, eine Validation dieser wird erwartet.

2. Probenverarbeitung: Vollblut-Proben müssen zentrifugiert und abpipettiert werden, Tupferproben sind direkt verarbeitungsfähig. Es erfolgt die Zugabe von farblich markierten Reagenzien nach Anwendungsanweisung.

3. Detektion: Das Testgerät übernimmt die DNA-Vervielfachung und die Erregerdetektion voll automatisch.

 Dank kompakter Bedienungs-Anweisung und farblicher Markierungen sind die EPONA-Tests leicht in der Anwendung und in jedem grundausgestatteten Labor durchführbar.

 Die Tests umfassen zwei übergeordnete Krankheitskomplexe mit insgesamt neun Erregern:

1. Fiebererkrankungen („isolated fever syndrome“) des Pferdes:

- Borrelia spp.
- Theileria equi
- Babesia caballi
- Anaplasma phagocytophilum
- Leptospira spp.

2. Atemwegserkankungen („acute respiratory syndrome“) des Pferdes

- Streptococcus equi sp. equi
- EIV (Equines Influenza Virus)
- EHV-1 (Equines Herpes Virus 1)
- EHV-4 (Equines Herpes Virus 4)

Die Sensitivität und Spezifität ist vergleichbar und teilweise höher, als vergleichbare PCR-Untersuchungen in externen Labors. Jede Testeinheit enthält außerdem eine individuelle Validierungsdatei, sowie eine Positivkontrolle. Diese bestätigt die korrekte Durchführung des Testverfahrens und agiert darüber hinaus als Qualitätskontrolle der Probenentnahme.

Die ASTÉRIA-Tests für Kleintiere werden in Kürze erhältlich sein. Sowohl die Pferde- als auch die Kleintiertests können über dasselbe Testgerät ausgewertet werden.

Fazit

Die LAMP-Technologie ermöglicht eine schnelle und sichere Diagnostizierung infektiöser Erreger im hauseigenen Labor. Besonders bei Verdachtsfällen hochansteckender Krankheiten ermöglicht die Zeitersparnis von 1-3 Tagen ein schnelles Handeln und den zügigen Therapiebeginn. So kann weiteren Krankheitsfällen vorgebeugt werden und das Stallmanagement unverzüglich zur Tat schreiten. Pferdebesitzern können zeitnah Antworten gegeben und Sorgen möglicherweise genommen werden.

Autor: Sabrina Thomeczek

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